本发明公开了一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统,属于基因工程领域。本发明构建了适用于双质粒转化的载体。省去了先在大肠杆菌中进行多拷贝复制,可直接进行枯草芽孢杆菌的转化,并且能够通过通过外源添加相应的诱导剂,诱导目的蛋白的表达。此系统表达效果稳定,以枯草芽孢杆菌为宿主,得到的产物安全无致病性,适用于多种生产场景。

本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，含有双质粒系统，所述双质粒系统包含如下两种质粒：

第一质粒：含有诱导型启动子A、目的蛋白A和诱导型启动子B的抑制蛋白；

第二质粒：含有诱导型启动子B、目的蛋白B和诱导型启动子A的抑制蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导型启动子A或B包括乳糖诱导型启动子、木糖诱导型启动子、阿拉伯糖诱导型启动子或四环素诱导型启动子中的任一种。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子A和启动子B为不同的启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述第一质粒以pHT01载体为出发载体，所述第二质粒以pBSG03载体为出发载体。

在本发明的一种实施方式中，pBSG03载体的构建方法记载于文献Guan C,Cui W,Cheng J,# and development of an auto-regulatory geneexpression system in Bacillus subtilis[J].Microbial Cell Factories,2015,14(1):150。

在本发明的一种实施方式中，所述第一质粒和第二质粒均切除了大肠杆菌转录复制子。

质粒是一种共价闭合环状的DNA且具有自我复制和表达外源基因的功能。由于其在不同的宿主中具有良好的自我复制能力，所以在基因工程及分子生物学领域中常被作为载体用于表达目的基因。在进行基因工程的改造和研究中通常一个宿主菌中只转化一种质粒，这是因为质粒具有不相容性，即同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内。目前也有转化同一种质粒到大肠杆菌中构建形成双质粒系统进行双酶的表达。通过添加抗生素作为外部选择压力使双质粒保持稳定，但表达得到的酶产量及效果都不太理想。

目前已经报道的在微生物中关于基因震荡器的内容，主要是通过单一诱导剂对其中的抑制蛋白进行表达调控，从而对对应需要激活剂激活表达的启动子产生抑制效果。该可抑制启动子分别启动报告基因和激活剂的转录表达。而且构建所用的宿主菌多为大肠杆菌，但大肠杆菌是领域公知的致病菌，影响了蛋白的安全性，并且若重组表达的外源蛋白中含有大量连续的稀有密码子，则常常造成表达量低，或翻译提前终止，目标蛋白质容易形成包涵体而不可溶。

因此，需要提供一种能够便于调控、并有效表达蛋白、又具有安全性能的表达系统。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明构建了适用于双质粒转化的载体。省去了先在大肠杆菌中进行多拷贝复制，可直接进行枯草芽孢杆菌的转化，并且能够通过外源添加相应的诱导剂，诱导目的蛋白的表达。此系统表达效果稳定，以枯草芽孢杆菌为宿主，得到的产物安全无致病性，适用于多种生产场景。

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